中风1号对急性期脑出血大鼠bcl-尊龙凯时网娱乐官网

［摘要］ 目的 通过应用活血化痕中药制剂中风 1 号治疗急性期脑出血大鼠，观察脑组织中 bcl-2和bax蛋白表达的变化，探讨其作用机制。 方法 以大鼠自体尾静脉取血制作脑出血大鼠模型，造模3 d后断头取脑，应用免疫组织化学法检测脑组织中 bcl-2、bax 免疫反应阳性细胞计数。 结果 造模后经治疗3 d，与模型组相比，中风1号组及甘露醇组 bcl-2阳性细胞数明显升高（p < 0.05)，bax阳性细胞数明显降低(p < 0.05)，中风1号组与甘露醇组 bcl-2/bax比值远大于1。 结论 活血化痕制剂中风1号通过调控抗凋亡基因 bcl-2、bax的表达，对急性期脑出血起到治疗作用。

［关键词］  急性期脑出血  中风1号  活血化痕  bcl-2 bax

脑出血属于中医出血性中风范畴^[1]。 如何降低脑 血管疾病的死亡率和致残率一直是医学界要攻克的重 点。 随着医学界的专家们对急性脑血管疾病的不断探 索， 应用中医中药治疗急性脑出血逐渐受到国内外专 家的重视，临床研究也显示疗效显著^[2-4]。 中风 1号为本文通信作者朱永志教授总结四十余年治疗急性期脑 出血经验形成的方剂，主要功效为活血化痕。脑出血多 为痕阻脑窍，痕血在急性期不除反而阻碍脑组织血运循环使致残率增加。前期动物实验发现中风1号可以 减轻脑水肿、保护神经组织^[5]，为中医内科保守治疗急 性脑出血奠定了基础。本次实验研究将在前期研究的 基础上进一步明确中风1号治疗急性期脑出血的作用机制。

1    材料与方法

1.1 实验动物  spf级别sd雄性大鼠40只，许可证号scxk(京)2016-0006， 体质量180～220 g，由黑龙江中医药大学动物实验中心代为购买。普通专用饲料喂养于温度(22±4) ℃，相对湿度 40%～70%，自然光线的实验室，经过1周的适应性饲养后进行实验。本

实验严格遵守动物福利与伦理原则， 在黑龙江中医 药大学实验动物管理和使用委员会监督下进行，伦理号2017092001。

1.2 试药及仪器  1)试剂：兔抗大鼠 bcl-2、bax多克隆抗体购自abcam公司；即用型快速免疫组化 max vision^tm 试剂盒及dab显色试剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。2)药物：中风1号(组成：水蛙10 g，生大黄 10 g，泽泻 15 g，三七粉 10 g，生地黄 15 g。由黑龙江中医药大学附属第一医院制剂室熬制)，按动物体表面积比率换算大鼠灌胃量，常规水煎至 3.5 g/ml(每毫升含生药 3.5 g)。阿莫西林纳舒巴坦纳（哈药集团生产，批号17070703-2)，甘露醇(石家庄四药有限公司生产，批号1709130503)。 3)仪器：大小鼠脑定位仪(上海玉研科学仪器有限公司生产)、 脑立体定位进样针(上海玉研科学仪器有限公司生产)、动物颅骨钻（上海玉研科学仪器有限公司生产)、 切片机 (德国莱卡生产)、超净工作台(苏净安泰生产)、光学显微镜(日本奥林巴斯公司生产)。

1.3  分组及造模  sd大鼠40只随机分为4组，每组10只，分别为假手术组、模型组、中风 1 号组、甘露醇 组。 除假手术组外，其余大鼠参照文献^[6]的方法制备模型。用 10%水合氯醒按大鼠体质量计算麻醉药用量 进行腹腔注射麻醉。大鼠俯卧位固定于立体定位仪上，充分暴露囱门消毒备皮后切开大鼠头顶部正中线皮肤约1 cm，暴露骨膜及前囱点，在前囱点右侧3.5 mm，后0.2 mm处用牙科钻钻出直径约1.0 mm的圆孔，深达硬 脑膜表面。同时鼠尾用酒精消毒，距尾末端3 cm处剪断用微量注射器抽取50 µl血液，把微量注射器固定在 立体定位仪上，针头沿钻孔进针约6 mm，以20 µl/min速度将50 µl血液缓慢推进脑组织，留针观察约5 min后缓慢出针。在留针期间包扎大鼠尾部伤口。取适量牙科水泥用纯净水调成糊状封闭颅骨创口，待牙科水泥略干后缝合头皮并用腆盼局部消毒，可在伤口表面撒 适量抗生素以防止感染影响指标变化。假手术组：动物 接受与模型组相同的操作但脑组织不注血。

1.4 给药方法  在造模后2 h大鼠完全苏醒后开始计时，中风1号组每日2 ml中药汤剂(剂量约为成人用量的1倍)灌胃，假手术组、模型组每日等量生理盐水灌胃，甘露醇组给予大鼠尾静脉注射甘露醇0.5 g/（kg•d），共给药3 d。

1.5 标本采集与检测  给药3 d后，大鼠吸人麻醉后颈椎离断处死，开颅取脑，以针道为中心，前后各移动2 mm切取4 mm厚脑组织。将切片浸于二甲苯中脱蜡0.5～1 h，乙醇脱水(步骤为100%乙醇5 min、100%乙醇5 min、95%乙醇5 min、80%乙醇5 min)，蒸馆水冲洗。在室温下切片，用 3%甲醇双氧水封闭 20～30 min，自来水冲洗；采用高压修复之后放人pbs中。 然后用免疫组化笔将组织围住，切片上滴加山羊血清封闭液， 保持在室温20～30 min。 甩去多余液体，不洗，再在切片上滴加目的一抗，4 ℃过夜，次日取出来后待切片恢 复至室温后，放人pbs洗3次，每次5 min。 切片上滴加二抗，37 ℃避光20 min后，放人pbs中洗3次，每次5 min，然后滴加dab染液显色5～10 s，水洗终止显色。最后采用苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片完成。选择各组的阳性和阴性组织相进行显微照相； 选择各组有意义的组织相进行读取分析，最后存盘。显微镜下bcl-2和bax阳性反应物在胞浆或胞核有棕色颗粒者为阳性细胞，计数阳性细胞。

………………………………………………………………………………………………………………